La història de The Binding of Isaac es basa en la història de la bíblia del mateix nom. Isaac i la seva mare viuen en una casa situada en un turó, tots dos mantenint-se a si mateixos pacíficament, amb Isaac dibuixant i jugant amb les seves joguines, mentre la seva mare mira programes de televisió cristians. Portaven una vida simple, i vivien feliços. Això va ser fins que un dia, la mare d'Isaac escolta "una veu de dalt", que diu que el seu fill està corrupte pel pecat, i ha de ser salvat. La veu li demana que li tregui tot el que és dolent per a ell. Ella accedeix, li treu les seves joguines, fotos, el portàtil, i fins i tot la seva roba. La veu llavors crida a la mare d'Isaac altra vegada, assenyalant que ha de ser allunyat de tota la maldat d'aquest món. Novament, segueix les seves ordres i tanca a Isaac a la seva habitació. Finalment, la veu li parla una altra vegada. Aquesta li diu que ha fet bé, però que encara dubta de la seva fe, llavors, la veu la ordena sacrificar a Isaac. Ella accedeix, agafant un ganivet de cuina i després dirigint-se al quart d'Isaac. Isaac, veient per una esquerda a la porta, comença a entrar en pànic, fins que troba una trampeta sota de la seva catifa que porta al soterrani, i just quan la seva mare entra a la seva habitació, ell obre la trampeta, i salta a les profunditats desconegudes del soterrani.